Citometria a Flusso: Principi, Applicazioni e Analisi Dati
La citometria a flusso misura simultaneamente molteplici parametri fisici e fluorescenti su singole cellule in sospensione ad alto throughput (10.000–50.000 eventi/sec).
Principi Fondamentali
- Focalizzazione Idrodinamica: Campione centrato in fluido guaina → interrogazione single-file.
- Diffusione Luce: FSC (forward scatter ≈ dimensione), SSC (side scatter ≈ granularità/complessità).
- Fluorescenza: Anticorpi coniugati fluorocromi legano antigeni bersaglio; laser eccitano; detettori catturano emissione (filtri bandpass).
- Compensazione: Correzione sovrapposizione spettrale tra fluorocromi.
- Gating: Plot sequenziali isolano popolazioni interesse (es. linfociti → singoletti → CD3+ → CD4/CD8).
Applicazioni Chiave
| Campo | Usi |
|---|
| Immunofenotipizzazione | Sottopopolazioni linfociti (T/B/NK), marcatori attivazione, Tregs, esaurimento (PD-1, TIM-3) |
| Malignità Ematologiche | Diagnosi leucemia/linfoma (marker CD), MRD (10⁻⁴–10⁻⁶), assegnazione lignaggio |
| Ciclo Cellulare / Proliferazione | Ki-67, DAPI/PI, BrdU/EdU — frazione S/G2/M |
| Apoptosi | Annexin V / 7-AAD o PI — apoptosi precoce/tardiva |
| Funzionali | Cattura citochine (ICS), phospho-flow (pSTAT, pERK), flusso calcio, ROS, potenziale mitocondriale |
| Cell Sorting (FACS) | Isolamento alta purezza per genomica, coltura, trapianto |
Avanzamenti Moderni
- Citometria spettrale (40+ parametri, unmixing autofluorescenza)
- Citometria di massa (CyTOF) — anticorpi metal-tagged, 40+ params, niente sovrapposizione spettrale
- Imaging flow cytometry (morfologia + fluorescenza)
- Single-cell multiomics (CITE-seq, REAP-seq: proteina superficie + trascrittoma)
Controllo Qualità
- QC beads giornalieri (allineamento, sensibilità, stabilità fluorescenza)
- Standardizzazione: EuroFlow, ICCS, pannelli CYTOF.
- Biosicurezza: BSL-2 per campioni umani non fissati; fissazione per spedizione.