Assay ELISA: guida completa a principi e procedura

L'ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, immunoassorbimento enzimatico) è una tecnica biochimica di laboratorio per rilevare un antigene (es. una proteina) o un anticorpo in un campione sperimentale. L'assay sfrutta il legame anticorpo-antigene e può analizzare altri meccanismi di legame cellulare e molecolare.

In un ELISA proteico, un anticorpo o proteina "cattura" viene deposto in una piastra e lasciato aderire; poi si aggiunge l'agente "sonda" (es. la proteina d'interesse) e si incuba con l'agente di cattura. Dopo diversi lavaggi, si aggiunge un anticorpo "rilevamento" per visualizzare la presenza o assenza di legame anticorpo-antigene o proteina-proteina.

Occorrente

• Piastra per assay (es. blocco a 96 pozzetti)
• Anticorpo cattura (diluito a 5 µg/mL in 50 mM NaHCO₃, pH 9,6)
• Anticorpo/proteina sonda (diluito a varie concentrazioni)
• Anticorpo rilevamento (es. anticorpo coniugato con perossidasi di rafano)
• Buffer PT (1x PBS, 0,05% Tween-20)
• Buffer blocco (1x PBS con 5 mg/mL BSA, o 5% latte scremato in 1x PBS)
• Reagente rilevamento (es. miscela reagente TMB)
• Agitatore meccanico da laboratorio
• Stanza fredda o frigorifero
• Pipetta e puntali

Istruzioni

1. Diluire l'anticorpo cattura a 5 µg/mL in 50 mM NaHCO₃ (pH 9,6). Aggiungere 50 µl per pozzetto. Coprire con pellicola o alluminio e incubare overnight a 4 °C su agitatore.

2. Rimuovere l'anticorpo cattura e lavare 2 volte con 200 µl buffer PT. Aggiungere 200 µl buffer blocco per pozzetto. Incubare 2 ore-overnight a 4 °C sotto agitazione.

3. Rimuovere buffer blocco e lavare 4 volte con 200 µl buffer PT. Aggiungere campioni proteici "sonda" a varie concentrazioni in buffer blocco, 100 µl per pozzetto. Incubare 1 ora a 4 °C sotto agitazione. Rimuovere soluzioni sonda e lavare 6 volte con 200 µl buffer PT.

4. Aggiungere anticorpo rilevamento (anticorpo HRP-coniugato) diluito 1:4000 in buffer blocco (con 0,05% Tween-20), 50 µl per pozzetto. Incubare 30-60 min a 4 °C sotto agitazione.

5. Rimuovere anticorpo rilevamento e lavare 6 volte con 200 µl buffer PT per pozzetto, poi 2 volte con 200 µl 1x PBS. Rimuovere PBS e aggiungere 100 µl reagente rilevamento per pozzetto (per HRP: TMB fresco mescolando substrato TMB e perossido 1:1). Incubare 15 min a temperatura ambiente, agitandooccasionalmente. Con TMB e HRP: aggiungere infine 100 µl H₃PO₄ 1M per pozzetto per bloccare la reazione TMB. Leggere la piastra con lettore per analisi campioni (es. lettore 96 pozzetti). Per HRP e TMB, usare template "ELISA End-Point Assay" disponibile sulla maggior parte dei lettori.