Misurazione della vitalità cellulare: guida completa

Misurare la vitalità cellulare con il blu di tripano

Nella maggior parte degli esperimenti biologici che coinvolgono colture cellulari, un passaggio critico è sapere quali cellule sono vive e quali morte nel campione. L'esclusione del colorante è il metodo più popolare per misurare la vitalità cellulare. Si basa sulla teoria che le cellule vive hanno membrane intatte mentre quelle morte no, quindi le cellule morte assorbono il colorante nel citoplasma. Esistono diversi coloranti e protocolli; la scelta dipende da costo, sensibilità, facilità e durata della procedura. Il blu di tripano è un colorante comune perché la procedura richiede 5-10 minuti e costa solo il reagente colorante.

Materiale necessario

• Reagente blu di tripano 0,4%
• Emacitometro
• Vetrino coprioggetto
• Micropipetta
• Puntali per pipetta
• Soluzione salina fosfato tamponata (PBS)
• Microscopio ottico

Procedimento

1. Ottenere un pellet delle cellule da misurare.

2. Risospingere il pellet cellulare in PBS per ottenere circa 5 x 10⁵ cellule/ml. Il PBS è usato perché le misurazioni di vitalità sono più accurate quando le cellule sono in un ambiente privo di siero; le proteine del siero possono anche colorare e dare risultati fuorvianti.

3. Aggiungere parti uguali di sospensione cellulare in PBS e parti uguali di colorante blu di tripano 0,4% per ottenere una diluizione 1:2 (esempio: 100 µl di cellule + 100 µl di blu di tripano) e mescolare pipettando su e giù.

4. Incubare la miscela per meno di tre minuti a temperatura ambiente. Se le cellule vengono contate dopo circa cinque minuti, la vitalità sarà inaccurata a causa della morte cellulare.

5. Con il vetrino coprioggetto già in posizione, riempire ogni lato del contatore dell'emacitometro con la sospensione cellulare. Tipicamente ogni lato richiede 10-20 µl.

6. Posizionare l'emacitometro sul palco del microscopio ottico e mettere a fuoco sulle cellule.

7. Ogni lato dell'emacitometro contiene più quadrati. Contare il numero totale di cellule in un quadrato. Poi contare separatamente le cellule non vitali (blu) e vitali (chiare) nello stesso quadrato.

8. Calcolare la percentuale di cellule vitali nel quadrato dividendo il numero di cellule vitali per il totale e moltiplicando per 100. Ripetere per più quadrati per ottenere una media della vitalità.