Coltura di Cellule T: Metodi, Fonti e Applicazioni

Le cellule T, appartenenti a una famiglia di cellule immunitarie chiamate linfociti, vengono generate durante una risposta immunitaria adattiva. Le cellule T originano da cellule staminali del midollo osseo e maturano nel timo. Esistono diversi tipi di cellule T, ciascuno con una funzione diversa. Si distinguono per il recettore per l'antigene T-cellulare associato. Un sottoinsieme porta il marcatore CD4 e aiuta a indurre una risposta immunitaria.

Fonti di Cellule T

Le cellule T possono essere ottenute da varie fonti, tra cui milza, linfonodi e timo, ma il sangue periferico è la fonte più facilmente disponibile per scopi di coltura. I campioni di sangue vengono accuratamente screening per infezioni e contaminanti e manipolati con cura sotto cappa di sicurezza. Le cellule T vengono coltivate per vari motivi, tra cui misurazioni di tossicità e studio delle risposte immunologiche ai vaccini.

Isolamento

Le cellule T vengono comunemente separate da campioni di sangue intero tramite separazione a gradiente di densità, poiché sono meno dense dei globuli rossi come gli eritrociti e vengono estratte per centrifugazione. Si aggiunge una soluzione salina neutra appropriata al campione di sangue, seguita da una soluzione Ficoll-isopaque. Il Ficoll-isopaque ha densità maggiore delle cellule T ma minore degli eritrociti e durante la centrifugazione forma uno strato intermedio tra entrambe le cellule, permettendo la rimozione delle cellule T dallo strato superiore. Le cellule T vengono ulteriormente centrifugate, il surnatante rimosso, e un piccolo aliquota conteggiata per determinare la vitalità cellulare. Le cellule vengono usate direttamente per esperimenti o criopreservate per uso futuro.

Criopreservazione

I reagenti per criopreservazione vengono preparati in anticipo per evitare degradazione delle cellule T a temperatura ambiente. Se non possibile, le cellule vengono mantenute su ghiaccio o refrigerate. I reagenti consistono in terreno di coltura cellulare e 10-13% di albumina sierica umana (HSA), nonché terreno di coltura e 10% di Dimetilsolfossido (DMSO). Il DMSO minimizza disidratazione, cambiamenti di pH e concentrazione elettrolitica associati al congelamento. Le cellule T vengono risospese nel terreno contenente reagenti e HSA in una criotubo. Il reagente contenente DMSO viene aggiunto lentamente alle cellule e mescolato delicatamente. Le cellule vengono poi trasferite in un contenitore di congelamento contenente isopropanolo per garantire una diminuzione graduale della temperatura e conservate.

Scongelamento

Quando le cellule T vengono scongelate, una criotubo viene rimossa dalla conservazione e incubata a 37°C. Successivamente, il mezzo di scongelamento appropriato viene aggiunto lentamente alle cellule fino a raggiungere il doppio del volume, trasferito in un tubo separato e centrifugato. La Benzonase viene talvolta aggiunta al mezzo di scongelamento per prevenire l'agglomerazione di cellule T morte. Il pellet centrifugato viene risospeso in terreno di coltura cellulare e la vitalità cellulare valutata. Le cellule T sono poi pronte per gli esperimenti rispettivi.