Colorazione Gel Agarose: Guida Completa per Visualizzazione Chiara
La visualizzazione di acidi nucleici o proteine è essenziale nell'elettroforesi su gel di agarosio. Senza colorazione, non si vede dove il campione è arrivato, limitando severamente misure come peso molecolare. Colorare il gel con un colorante comune e ben testato come bromuro di etidio (EtBr), che fluoresce sotto luce UV quando intercalato in DNA o RNA. Il colorante mostra le molecole del campione come bande blu scuro.
Materiali Necessari
- Guanti e occhiali di sicurezza
- Gel di agarosio
- Bromuro di etidio
- Pipetta (Gilson per piccoli volumi)
- Buffer di carico
Procedura
- Indossare guanti sottili ma protettivi che lascino libertà alle dita. Usare una micropipetta per prelevare EtBr (o colorante equivalente) dal contenitore.
- Aggiungere 0,5 µg/mL di colorante al campione. Coprire e mescolare manualmente. Poche scuotute sono sufficienti.
- Aggiungere buffer di carico a carica negativa con pipetta. Permette di vedere il campione colorato a occhio nudo, in luce naturale, eliminando la necessità di UV costoso e dannoso che degraderebbe le molecole d'interesse. Xylene cyanol è un buffer di carico comune, ma ce ne sono altri. Sceglierne uno che migri alla stessa velocità della molecola da misurare. Xylene cyanol corre alla velocità di frammenti DNA di 5000 bp.
- Usare una pipetta pulita per applicare il campione potenziato nei pozzetti all'inizio del gel. Il volume dipende dalla dimensione dei denti del pettine (spessore/lunghezza pozzetto e spessore gel). Colorare il campione e non il controllo per determinare correttamente i parametri d'interesse (es. peso molecolare).
- In alternativa, eseguire Southern Blotting per visualizzare il campione. Trasferire il DNA su membrana di nitrocellulosa. Esporlo a una sonda di ibridazione. Non è colorazione, ma fornisce alternativa valida, come descritto da Access Excellence.