Clonazione Molecolare: Protocolli per Sequenziamento e Replicazione DNA

I protocolli di clonazione molecolare comprendono procedure per definire, isolare e replicare una sequenza DNA. Protocolli tradizionali restrizione-ligazione: frammentazione DNA con endonucleasi di restrizione (enzimi tagliano DNA in siti restrizione), ligazione frammenti DNA (riparazione discontinuità molecole DNA), trasfezione (introduzione acido nucleico in cellula), selezione (scelta genomi individuali per replicazione).

Isolamento

Protocolli isolamento frammento DNA (primo passo clonazione molecolare) spesso incorporano reazione a catena polimerasica (PCR): cicli riscaldamento/raffreddamento amplificano pezzi DNA. Per raggiungere dimensione sequenza obiettivo, altri protocolli: sonicazione DNA, digestione enzimi restrizione, oligonucleotide sintetizzati chimicamente. Protocolli variano per quantità e grandezza DNA isolato necessario.

Ligazione

Protocolli ligazione usano enzima DNA ligasi per unire molecole DNA con legame covalente. Protocollo: combinare frammenti DNA, vettore clonazione, buffer ligazione, DNA ligasi, acqua sterilizzata in microtubo centrifuga, incubare overnight a 4°C.

Trasfezione

Protocolli trasfezione (infusione DNA in cellula con mezzi non virali) spesso: iniezione diretta DNA in citoplasma. Altri metodi: reagenti chimici (fosfato calcio, lipidi) per veicolare complesso trasfezione attraverso membrana cellulare. Testa effetti modifica genica su funzionamento geni specifici.

Selezione

Protocolli selezione/screening determinano quali cellule hanno mantenuto inserto DNA e quali isolare. Centrifuga raccoglie cellule con DNA trasfetto, incubate in buffer lisozima (enzima naturale) + detergente alcalino → solubilità proteine/membrane. Acetato per precipitare proteine, centrifuga e filtro garza per surnatante DNA-contenente (liquido solubile da composto centrifugato). Surnatante precipitato con polietilenglicole, centrifugato, sospeso in buffer cloruro cesio/bromuro etidio. Bromuro etidio colora DNA per densità, luce UV onda lunga → banda DNA inferiore estratta con siringa 5cc. Colonna scambio ionico equilibrata separa DNA da bromuro etidio/cloruro cesio, pellet DNA finale sospeso in buffer e rilevato su elettroforesi gel agarosio.