Etichettatura Substrati Proteasi: Best Practice per Identificazione Prodotti
Contesto Scientifico
Le proteine sono un componente di ogni cellula del corpo. Le proteasi (chiamate anche enzimi proteolitici o proteinasi) sono enzimi digestivi la cui funzione è scomporre le proteine. Oltre alla digestione, le proteasi sono essenziali anche per la coagulazione del sangue, il controllo metabolico e la regolazione immunitaria. Durante il processo biochimico (catalisi), i substrati si legano al sito attivo dell'enzima e vengono trasformati in uno o più prodotti che vengono poi rilasciati dal sito. Questo processo può essere aumentato o inibito per aumentare o ridurre le reazioni nel corpo, a seconda del risultato desiderato. L'etichettatura dei prodotti substrato permette agli scienziati di misurare questa attività enzimatica. L'etichettatura fluorescente è una tecnica usata per colorare particolari molecole, rendendole più facili da tracciare.
Materiale Necessario
- Cocktail molecola target
- Kit etichettatura colorante fluorescente
- Strumento lettura fluorescenza
Procedura di Etichettatura
- Scegliere il colorante fluorescente. Coloranti comuni includono rodamina e fluoresceina. Di solito possono essere acquistati dai produttori.
- Eseguire la reazione e rimuovere fluorofori inutilizzati dalle molecole target usando cromatografia di esclusione per dimensioni (processo che separa le molecole in base alle loro dimensioni). Le colonne di rimozione colorante sono anche comunemente usate. Spesso sono pubblicizzate con i kit di etichettatura.
- Rilevare le molecole. Usare uno strumento di lettura fluorescenza, come un microscopio a fluorescenza. Luce di una lunghezza d'onda specifica passa attraverso la molecola (indirettamente per alcune tecniche), illuminando il fluoroforo.
- Effettuare le misurazioni. Poiché i saggi misurano quanto substrato è stato consumato o la quantità di prodotto rilasciato in un periodo di tempo, le quantità enzimatiche possono essere misurate in moli (quantità fisica) o in unità enzimatiche (attività).