Analisi cinetica digestione BAPNA da tripsina: comportamento Michaelis-Menten tempo-dipendente
L'idrolisi di N-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilide (BAPNA) da tripsina segue cinetica classica Michaelis-Menten, rendendola assay standard per attività proteasi serina.
Fasi cinetiche
- Fase velocità iniziale (V₀): [S] >> Kₘ; velocità costante e proporzionale a [E]. Formazione lineare prodotto (p-nitroanilina rilasciata misurata a 410 nm).
- Fase transizione: Concentrazione substrato declina; velocità rallenta mentre saturazione enzima diminuisce.
- Plateau: Substrato esaurito; reazione si avvicina completamento.
Descrizione matematica
Equazione Michaelis-Menten integrata per curva progresso:
t = (Kₘ/Vₘₐₓ) ln([S]₀/[S]ₜ) + ([S]₀ - [S]ₜ)/Vₘₐₓ
Dove [S]₀ = concentrazione substrato iniziale, [S]ₜ = concentrazione al tempo t.
Determinazione parametri
- Misurare velocità iniziali a vari [S]₀.
- Grafici Lineweaver-Burk (1/v vs 1/[S]), Hanes-Woolf ([S]/v vs [S]), o Eadie-Hofstee (v vs v/[S]) forniscono Kₘ e Vₘₐₓ.
- kcat = Vₘₐₓ/[E]ₜ; efficienza catalitica = kcat/Kₘ.
Considerazioni sperimentali
- Condizioni standard: pH 8,0 (Tris-HCl), 37°C.
- Ca²⁺ stabilizza tripsina; evitare chelanti (EDTA).
- Effetto filtro interno ad alto [S] o accumulo prodotto — correggere matematicamente o diluire campioni.
Questo assay è fondamentale per caratterizzazione enzimi, screening inibitori, monitoraggio bioprocessi.