Salute e malattia
Le procedure di crioconservazione permettono di conservare le cellule indefinitamente usando temperature estremamente fredde per sospendere le attività metaboliche. Esistono due principali tipi: equilibrio (congelamento lento convenzionale) e non-equilibrio o ultra-rapido (vitrificazione). Il termine vitrificazione deriva dal latino "vitreous" (vitroso). Entrambe le procedure usano crioprotettori con proprietà antigelo per prevenire danni cellulari durante il congelamento. Una volta congelate o vitrificate, le cellule possono essere conservate indefinitamente immergendole in azoto liquido, un fluido estremamente freddo a -196 °C (-321 °F). Per ripristinare l'attività metabolica nella cellula allo scongelamento, i crioprotettori tossici devono essere rimossi e il normale equilibrio idrico gradualmente ripristinato mentre la cellula ritorna a temperatura di funzionamento normale.
Le procedure di crioconservazione permettono di conservare le cellule indefinitamente usando temperature estremamente fredde per sospendere le attività metaboliche. Esistono due principali tipi: equilibrio (congelamento lento convenzionale) e non-equilibrio o ultra-rapido (vitrificazione). Il termine vitrificazione deriva dal latino "vitreous" o vetroso. Entrambe le procedure usano crioprotettori con proprietà antigelo per prevenire danni cellulari durante il congelamento. Una volta congelate o vitrificate, le cellule possono essere conservate indefinitamente immergendole in azoto liquido, un fluido estremamente freddo con temperatura di -196 °C (-321 °F). Per ripristinare l'attività metabolica nella cellula allo scongelamento, i crioprotettori tossici devono essere rimossi dalla cellula e il normale equilibrio idrico gradualmente ripristinato mentre la cellula ritorna a una temperatura di funzionamento normale.
La procedura usata per crioconservare cellule o tessuti dipende da fattori tra cui dimensioni della cellula, quantità di fluido cellulare (citoplasma) e complessità (cellula singola o tessuto). Cellule con molto citoplasma come gli ovociti sono più difficili da crioconservare di cellule con citoplasma residuo, come gli spermatozoi. La crioconservazione di tessuto ovarico è più impegnativa perché sono presenti almeno tre tipi cellulari di dimensioni variabili, ciascuno con diverse esigenze di congelamento ottimali. I protocolli a congelamento lento hanno avuto successo con vari tipi cellulari. La vitrificazione è attualmente più efficace con congelamento monocellulare e meno con tessuti, ma la ricerca continua per ottimizzare la vitrificazione dei tessuti.
Il citoplasma contiene acqua, che forma cristalli di ghiaccio a temperature di congelamento. Quando il ghiaccio si forma dentro una cellula, questa viene lacerata e muore. Quindi il fluido nella cellula deve essere rimosso prima di raggiungere temperature di congelamento per evitare danni. Vari tipi di fluidi antigelo (crioprotettori) possono disidratare la cellula prima del congelamento, tra cui glicerolo, propanediol, dimetil solfossido (DMSO), etanolo e zuccheri come saccarosio e trealosio. La velocità ottimale di raffreddamento (e scongelamento) dipende dal tipo di crioprotettore usato e dalle caratteristiche della cellula o tessuto. I crioprotettori sono tossici per cellule metabolizzanti, quindi l'esposizione a temperature metaboliche più calde deve essere minimizzata o evitata. Allo scongelamento o riscaldamento, i crioprotettori devono essere completamente rimossi prima di ripristinare l'attività metabolica.
La velocità di congelamento dipende se il protocollo è basato su equilibrio o non-equilibrio. Per procedure di tipo equilibrio, la velocità ottimale si raggiunge quando c'è equilibrio tra la velocità di disidratazione cellulare e la velocità di trasformazione dell'acqua extracellulare in ghiaccio. Questi protocolli di equilibrio o congelamento lento richiedono solitamente ore e un computer gestisce un freezer a velocità programmabile per assicurare velocità esatte. C'è tipicamente una fase di "attesa" all'inizio per permettere la creazione manuale di cristalli di ghiaccio starter o "seeding" nel fluido extracellulare.
Nella vitrificazione, un approccio del tutto diverso che non si basa su rampe e raggiungimento di equilibrio tra disidratazione e formazione di cristalli di ghiaccio. La vitrificazione è così ultra-rapida che non c'è tempo sufficiente per la formazione di ghiaccio e il fluido cellulare si converte direttamente in una fase vitrea o vetrosa, senza danni alla cellula. Freezer a velocità programmabile non sono richiesti perché la cellula è immersa direttamente in azoto liquido estremamente freddo, raggiungendo uno stato vetroso istantaneo.
Il primo passo è esporre la cellula al crioprotettore in modo graduale a step per permettere lenta equilibrazione con il crioprotettore mentre rilascia acqua. Una volta che le cellule sono state liberate dalla maggior parte dell'acqua cellulare, le cellule nel fluido crioprotettore sono poste in un contenitore (cannuccia di plastica, ampolla di vetro o fiala di plastica). Il volume di liquido attorno alle cellule per congelamento lento è tipicamente meno di un cucchiaino e possono essere solo poche gocce. Il contenitore pre-etichettato è riempito, sigillato e messo in un freezer programmabile, che diminuisce lentamente la temperatura per minuti o ore a temperature molto basse. Dopo alcuni minuti di raffreddamento, cristalli di ghiaccio starter devono essere formati dentro il contenitore per "seeding". Il seeding è eseguito usando uno strumento (es. pinze) pre-raffreddato in azoto liquido per toccare il contenitore e causare formazione di cristalli di ghiaccio. Questo cristallo starter inizierà formazione controllata in un punto, lontano dalle cellule. Una volta completato il seeding, il resto delle rampe di raffreddamento può procedere. Quando il contenitore raggiunge temperature tra -30 e -85 °C, può essere immerso direttamente in azoto liquido per completare il raffreddamento a -196 °C.
Procedure di raffreddamento ultra-rapido non-equilibrio come la vitrificazione usano concentrazioni più alte di crioprotettori accoppiate a una velocità di congelamento quasi istantanea ottenuta immergendo le cellule direttamente in azoto liquido. La vitrificazione bypassa la fase di formazione di cristalli di ghiaccio e sposta l'acqua direttamente in una fase vetrosa. Raggiunge lo stesso endpoint del congelamento lento, ma a una velocità di -3000 °C/min, rispetto a 10 °C/min o più. Per la vitrificazione, le cellule sono solitamente poste sulla punta di una cannuccia e l'eccesso di crioprotettore è rimosso, lasciando solo abbastanza perché la cellula aderisca al contenitore per tensione superficiale, prima di immergere in azoto liquido. Poiché il congelamento è così rapido, la durata di esposizione ai crioprotettori è molto minore, e concentrazioni molto più alte possono essere tollerate. Il riscaldamento per riportare la cellula a funzionamento metabolico normale deve essere anche incredibilmente rapido. La manipolazione di campioni vitrificati è molto più esigente di quelli a congelamento lento perché anche una breve esposizione a temperatura superiore a quella dell'azoto liquido può iniziare un processo di riscaldamento non pianificato e ricongelamento, dannoso per la cellula.
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